基因治疗血友病的临床试验设计探讨

General considerations for clinical trials of gene therapy for hemophilia

赵晨阳， 黄云虹， 于爱平， 高晨燕

(国家药品监督管理局 药品审评中心， 北京 100022)

ZHAO Chen-yang, HUANG Yun-hong, YU Ai-ping, GAO Chen-yan

(Center for Drug Evaluation, National Medical Products Administration, Beijing 100022, China)

作者简介：赵晨阳(1990-)，女，博士，助理研究员，主要从事细胞和基因治疗产品临床审评研究

通信作者：高晨燕，主任药师

Tel：(010)85243053

E-mail：gaocy@cde.org.cn

摘要：血友病A或B是遗传性出血性疾病，由凝血因子Ⅷ或Ⅸ突变所致。目前凝血因子替代疗法仍为血友病A或B的主要治疗手段，该疗法需要频繁、终生进行凝血因子输注，以控制和预防出血。基因治疗为血友病患者提供了新的治疗选择，可能通过单次给药即实现长期、稳定的提升凝血因子水平，从而减少甚至停止凝血因子替代治疗、减少患者的出血和关节畸形。本文从有效性评价终点、临床试验设计、入组人群、受试者监测等方面，对基因治疗血友病的临床试验设计因素进行探讨，以期为研发企业提供参考。

关键词：基因治疗；血友病；临床试验；凝血因子；腺相关病毒

DOI：10.13699/j.cnki.1001-6821.2022.17.026

中图分类号：R97   文献标志码： C

文章编号：1001-6821(2022)17-2102-04

Abstract: Hemophilia A or B are congenital hemorrhagic diseases caused by mutations in blood coagulation factor Ⅷ (FⅧ) or factor Ⅸ (FⅨ) genes. Current conventional replacement therapy to control or prevent bleeding requires frequent injections of coagulation factor concentrates for the whole life. Gene therapy for hemophilia remains an exciting future prospect for patients which offers a long-term expression of coagulation factor by a single dose to reduce or even stop replacement therapy, frequency of bleeding and joint deformity. In this paper, we discussed the general issues in the clinical trials of gene therapy for hemophilia, including efficacy endpoint, study design, subjects and monitoring, etc ., in order to provide references for research for industry.

Key words: gene therapy; hemophilia; clinical trial; clotting factor; adeno-associated virus

血友病是一种X染色体连锁的隐性遗传性出血性疾病，由凝血因子基因突变引起，根据缺乏凝血因子的种类，可分为血友病A(凝血因子Ⅷ缺乏)和血友病B(凝血因子Ⅸ缺乏)。主要临床表现为关节、肌肉和深部组织出血，也可有胃肠道、泌尿道、中枢神经系统出血以及拔牙后出血不止等。目前血友病的主要治疗手段仍为传统的凝血因子替代治疗，首选基因重组凝血因子制剂、病毒灭活的血源性凝血因子制剂以及凝血酶原复合物等^[1]，替代疗法具有终身用药、可能产生抑制物(中和抗体)、病毒传播风险等特点。在传统的替代治疗方法之外，基因治疗可能为这些疾病提供更为方便的治疗选择。通过载体携带凝血因子基因，在体内表达凝血因子，或者使用基因编辑工具在体内修正突变基因，通过单次治疗实现理想的长期、稳定表达凝血因子，从而提高凝血因子水平或活性，以减少甚至停止凝血因子替代治疗、减少出血和关节畸形。

目前进入临床试验的血友病基因治疗集中于直接注射携带目的基因的载体，实现体内凝血因子的表达，提升凝血因子水平。大多以腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)为载体，以肝为递送靶器官。递送的基因有野生型凝血因子Ⅸ基因，也有高活性凝血因子Ⅸ突变体如R338L(Padua)基因，以及密码子优化的凝血因子Ⅷ基因。在www.clinicaltrials.gov上登记的以AAV为载体治疗血友病A的临床试验有32项，其中Ⅰ～Ⅱ期22项，Ⅲ期3项^[2]。干预性研究27项，观察性研究5项。以AAV为载体治疗血友病B的临床试验有21项，其中Ⅰ～Ⅱ期14项，Ⅲ期2项。干预性研究17项，观察性研究4项^[3]。其中，有3项登记单位为中国医疗机构或科研单位。现结合美国FDA在2020年发布的血友病基因治疗的指南^[4]，以及基因治疗血友病的临床试验进展，对基因治疗血友病的临床试验中需要考虑的一些因素进行探讨。

1 有效性评价终点

评价凝血因子有效性的指标主要有直观评价受试药物预防出血和止血效果的临床疗效指标，如年化出血率(Annualized Bleeding Rates，ABR)、出血症状和体征改善评分、靶关节(Target Joints)数等^[5]。

考虑到用于基因治疗载体体内表达的凝血因子与野生型凝血因子在蛋白结构和功能上可能存在区别，如删除B domain的凝血因子Ⅷ；转基因的凝血因子可能会比野生型凝血因子活性更高，如凝血因子Ⅸ突变体Padua，以及检测方法学上的问题，对于单次的基因治疗来说，以年化出血率为主的临床指标可能仍是目前比较合适的主要疗效指标。

如果要采用替代终点支持上市申请，需要能证明该终点很可能预测临床获益。需要根据疾病、临床终点和药物预期作用之间关系的生物学合理性以及支持这种关系的证据或经验进行判断。如替代终点与疾病病因的关系、替代终点与临床终点的关系及其预测价值、替代终点与疾病预后之间流行病学关系的相关程度、药物对替代终点的影响程度与药物对临床终点的影响程度的一致性等^[6]。在早期临床试验中，通过对受试者的长期随访，分析转基因凝血因子活性水平与年化出血率之间的关系，确定产品达到临床治愈或非劣于现有其他疗法的转基因凝血因子活性界值等，来证明凝血因子活性水平作为替代终点的合理性。

2 临床试验设计

在确证性试验中，对照的选择是试验设计的重要因素，对于基因治疗血友病来说，客观、真实的受试者基线数据可作为基因治疗后疗效的对照。如有的受试者基线数据无法从其他途径获得，在接受基因治疗前，可设置一个时间段以观察拟接受基因治疗的受试者的基线数据，如年化出血率、替代治疗使用情况、凝血因子水平等^[4]。例如，Pfizer公司在www.clinicaltrials.gov上登记一项观察性研究，为以AAV为载体治疗血友病A的产品SB-525和治疗血友病B的产品SPARK100设置了至少6个月的导入期研究，观察志愿者在接受基因治疗前，预防性替代治疗的安全性和有效性^[7]。

根据早期临床试验数据，在基因治疗后表达出到足够且稳定的凝血因子产物前，可使用其他替代治疗以减少或预防期间的出血。设置合理的凝血因子活性值，或者其他替代治疗的使用持续时间，以停止替代治疗，预先规定疗效评价的起始时间^[4]。

临床试验中，如受试者出现了肝毒性，可短期使用皮质类固醇进行控制并减少对凝血因子活性的影响，同时，也应准备好其他治疗措施以备类固醇治疗无效时使用。AAV进入肝细胞后，衣壳蛋白降解成短肽，呈递到肝细胞膜表面，引发CD8＋T细胞介导的细胞免疫，是引起肝毒性的原因^[8]。根据以AAV为载体的基因治疗产品临床试验经验，凝血因子Ⅷ和Ⅸ基因治疗后，分别有约53%和31%受试者出现了无症状的肝酶升高，可能伴随着凝血因子活性的降低^[9]。Pfizer和Spark公司以AAV为载体表达凝血因子Ⅸ(Padua)的产品SPK-9001，在进行Ⅰ/Ⅱ期临床试验时，2/10出现肝酶升高时使用了类固醇进行控制^[10]；UCL的同类产品在Ⅰ/Ⅱ期临床试验中，基因治疗后4～12周预防性使用了类固醇，未发现肝酶升高^[11]。

3 入组人群

用于基因治疗的病毒载体自然感染产生的预存中和抗体会影响其介导的基因治疗，这限制了中和抗体阳性患者采用基因疗法；单次基因治疗后产生中和抗体，也限制了再次使用同载体进行治疗。临床试验中应关注入选人群对产品所用载体的中和抗体水平^[4]。

以AAV为例，AAV中和抗体阳性率在不同国家有所不同。在我国北京和安徽健康人中进行的研究表明，AAV1中和抗体阳性率为69.8%(349/500)，青少年(＜18岁)中低于成年人(19～56岁)(50.0% vs. 71.3%)^[12]。AAV2、AAV5、AAV8 中和抗体阳性的比例分别为96.6%(483/500)，40.2%(201/500)，82.0%(410/500)。仅AAV 8中和抗体阳性率在青少年(＜18岁)中低于成年人(19～56岁)(67.6% vs. 83.2%)，其他2个血清型的中和抗体阳性率在不同年龄亚组水平相当。且我国人群的AAV2、AAV5、AAV8中和抗体阳性率显著高于发达国家^[13]。一项在日本85例健康人和59例血友病患者中进行的研究表明，AAV1、AAV2、AAV5、AAV8、AAV9型特异的中和抗体阳性率为27%～40%，健康人和血友病患者之间没有显著差别。针对以上5种AAV血清型均为阴性的仅有50%，其中＜42岁人群和＞42岁人群的AAV阴性率分别为18.6%和67%^[14]。适合我国人群的AAV载体，以及更优的治疗年龄的选择需要进一步的研究。

多个研究对减少AAV中和抗体抑制基因转导的方法进行了探索，以应对AAV为载体的基因治疗的挑战。如对衣壳进行修饰以找到对中和抗体抵抗的AAV突变体，化学修饰方法给AAV衣壳连接配体以保护其不被中和抗体结合，通过其他药物抑制免疫消除中和抗体，血浆置换，用内含体exosome包裹AAV等^[8，15]。

血友病是一种遗传病，影响成人和儿童，因此对儿科人群的研究十分重要。AAV载体主要以游离形式存在于细胞内，在缺乏辅助病毒情况下，不会复制。成人肝细胞大部分处于静止期，而在儿童发育过程中，肝细胞的分裂将稀释AAV携带的基因并可能最终导致治疗效果的减弱。目前利用AAV载体进行血友病基因治疗的临床试验仅包含成年患者^[16]。对于儿科人群的研究应遵守ICH E11(用于儿科人群的医学产品的临床研究)，并在成人中获得有效性和安全性数据后，考虑儿科人群的获益-风险比，包括并不限于基因表达持续时间、随肝的生长游离基因的稀释情况、以及潜在的插入突变风险等。

4 对受试者的监测

为明确转导基因表达的凝血因子情况，在基因治疗产品注射后，根据非临床试验结果，在推测凝血因子水平达到稳定前，可增加检测频率，如每周1次或2次。因子水平达到稳定后，建议定期检测凝血因子水平，如每月1次；在长期如治疗后2年后，可每半年检测1次，以获得凝血因子表达的持续时间和稳定性数据。在长期随访中，建议对血友病关节病的功能和结构进行评价^[4]。

现阶段在同类产品临床试验中发现的最主要的不良事件是肝酶升高^[9]。因此，临床试验中也应定期检测肝功能，检测频率可参考上文凝血因子。除此之外，潜在的基因毒性也是基因治疗的风险。AAV载体虽比慢病毒和逆转录病毒的插入突变几率低，但在AAV介导的基因治疗动物实验中仍发现了随机插入。也有研究发现，在11个肝癌样本中检测到了AAV2整合到癌症驱动基因中，导致其过表达，其中9个为无硬化，6个无其他危险因素，因此，研究认为AAV2的插入突变与肝癌发生有一定的相关性^[17]。根据基因治疗类型的不同，应对插入情况进行监测和分析。

凝血因子抑制物的累计发生率在重型血友病A患者为20%～30%，轻型和中间型血友病A患者为5%～10%，血友病B患者低于5%^[1]。目前的基因治疗临床试验中，大多在入组标准中对受试者先前治疗的暴露日有一定要求，虽临床试验结果表明凝血因子抑制物的发生低于预期^[9]，针对具体研发产品，仍应做好入组人群治疗后抑制物检测。

如果使用病毒载体用于携带治疗基因，应定期检测针对病毒载体产生的中和抗体，并评估病毒的脱落情况。

5 讨论

目前，全球有多种广义的基因治疗产品经药品监管机构批准上市，其中，以AAV为载体的体内基因治疗产品有3款，包括Glybera(因市场原因已退市)、Luxturna、Zolgensma。这些基因治疗为遗传性疾病在传统治疗方法之外提供了新的治疗选择，也给基因治疗领域提供了一些可行性证据。2017年至2021年，我国共批准了48个以嵌合抗原受体T细胞为主的基因修饰T细胞产品(其中2个已上市)，以及7个以疱疹病毒、痘苗病毒、腺相关病毒为主要载体的溶瘤病毒产品进入临床试验。

血友病已被卫健委等多部委联合发布的第一批罕见病名录收录^[18]，同时，血友病作为基因治疗的研究热点具有如下特征：单基因突变引起致病机制明确；凝血因子少量提高即能改善疾病症状；凝血因子治疗的有效范围较宽等^[19]。目前，全球多家企业开展了以AAV为载体携带凝血因子基因治疗血友病的临床试验，多个产品进入Ⅲ期阶段。利用其他载体类型如慢病毒，以及CRISPR/Cas9介导的基因编辑等手段，造血干细胞及血小板等作为靶细胞的基因治疗也在研发中^[20]。本文探讨了基因治疗血友病的临床试验中应考虑的一些因素，未涵盖临床试验设计中所有方面，国内研发企业在开展相关临床试验时，还需根据产品特点制定科学合理地设计临床试验方案，推进产品的研发和上市。

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